جداسازی دی.ان.ای از بافت گیاهی برای پی.سی.آر

جداسازی دی.ان.ای از بافت گیاهی برای پی.سی.آر   1- 100 میلی گرم برگ تازه را در ای-لوله 1/5  میلی لیتری (اپندورف تیوب)  دارای 400 میکرولیتر بافر جداسازی دی.ان. ای هموژنه کنید. *می توانید ابتدا بافت گیاهی را در نیتروژن مایع با کمک هاون بسایید و سپس به آن بافر را بیافزایید یا که ابتدا 200 میکرولیتر روی بافت گیاهی درون لوله بریزید و پس از همگن کردن با استفاده از همگن کننده 200 میکرولیتر دیگر بافر را بیافزایید.   2-ابتدا به شدت لوله را تکان بدهید . سپس به مدت 15 دقیقه در 65 درجه سانتیگراد یا 1ساعت در دمای اتاق (25 درجه سانتیگراد) بگذارید.   3-در 4 درجه سانتیگراد/12000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ کنید.   5-لایه رویی را به یک ای-لوله تمیز منتقل کنید و هم حجم آن  پی.سی.آی  روی آن بریزید و باشدت تکان دهید.   6- در 4 درجه سانتیگراد/12000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ کنید.   7--لایه رویی را به یک ای-لوله تمیز منتقل کنید و هم حجم آن  آی.پی.ای(ایزوپروپانول)  روی آن بریزید و به آرامی چند بار برگردانید.   8-به مدت 30 دقیقه در منفی 20 درجه سانتیگراد بگذارید.   9- در 4 درجه سانتیگراد/12000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ کنید.   10- با احتیاط الکل را دور بریزید.سپس رسوب دی.ان.ای را با اتانول 70% بشویید.   11- رسوب را خشک کنید تا الکلی در آن نماند.   12- بسته به اندازه رسوب آن را در چند تا چند ده میکرولیتر آب اتوکلاو شده یا بافر تی.ای حل کنید(معمولا 20 میکرولیتر).   13- نیم میکرولیتر آر.ان.ایز ایRNase A  با غلظت 10 میلی گرم در میلی لیتر به آن بیافزایید و 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهدارید.   14-کیفیت دی.ان.ای و مقدار آن را اندازه گیری کنید .سپس با استفاده از این دی.ان.ای  واکنش پی.سی.آر را انجام دهید.     جداسازی دی.ان.ای از بافت گیاهی برای پی.سی.آرPlant DNA extraction for PCR                                                                                                                                        Publish at Scribd or explore others:            Other              Academic Work                  plant              isolation