تراریختی ای.کولای E.coli به روش تکانه گرمایی

تراریختی ای.کولای E.coli به روش تکانه گرمایی1- باکتری( 100 میکرو لیتر) را در یخ بگذارید تا از حالت انجماد بیرون رود.2- 5 میکرو لیتر پلاسمید دارای ژن مورد نظر را به باکتری درون لوله میکروفیوژ ( ای- لوله) اضافه کنید.3- به مدت 20 دقیقه در یخ نگهداری کنید.4- در دمای 42 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه به باکتری تکانه گرمایی وارد کنید.5- برای دست کم 5 دقیقه باکتری را در یخ نگهدارید.6- 125 میکرولیتر محیط ال.بی (یا آر.تی.سوک) به آن بیافزایید.7- به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد تکان بدهید.8- باکتری را روی محیط جامد مورد نظرتان در ظرف پتری پخش کنید و در طول شب در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری کنید.9- فردا صبح کلنی های باکتری را بررسی کنید.10- توجه کنید باکتری هایی که پس از مدتی طولانی رشد می کنند قابل اعتماد نیستند یا اگر دیر به باکتریها سرکشی کنید کلنی های باکتری های تراریخت شده پیر می شوند و اطراف آنها کلنی های ماهواره رشد می کنند.باز کردن یخ بدون آسیب رساندن به جاندار یا توالی نوکلئوتید یخزده : thawتکانه گرمایی :heat shockطول شب :O/N

رنگ 2x غلظت برای تایید کیفیت آر.ان.ای

هر گاه خواستید کیفیت آر.ان.ای را ببینید این رنگ را با غلظت2 ایکس تهیه کنید و پس از این که آر.ان.ای را در 65 درجه سانتیگراد به مدت10 دقیقه گرما دادید بلافاصله آن را به یخ منتقل کنید و پس از سانتریفوژ به مدت کوتاه (اسپین دون) رنگ 2 ایکس غلظت را به آر.ان.ای اضافه کنید و آر.ان.ای  را در مینی ژل نیم ایکس تی.بی.ای -آگاروز 1.5 درصد ران کنید.ترکیب نهایی رنگ:فرمامید 95%اس.دی.اس 0.025% بی.پی.بی (بروموفنل بلو) 0.025% ایکس.سی.اف.اف(گزیلن سیانول اف.اف) 0.025%ای.تی- بی.آر (اتیدیوم بروماید) 0.025%ای.دی.تی.ای 0.5 میلی مولار

بافر استخراج دی.ان.ای برای پی.سی.آر

بافر استخراج دی.ان.ای برای پی.سی.آرغلظت نهایی اجزای تشکیل دهنده:Tris-HCl                  pH7.5  0.2M                                                    NaCl                               0.25M                                                    EDTA                              25mM                                                    SDS                                 0.5%برای تهیه 200 میلی لیتر بافر جداسازی:40 میلی لیتر                         Tris 1M10  میلی لیتر                       NaCl 5M10  میلی لیتر                   EDTA 0.5M5   میلی لیتر                     SDS 20%

جداسازی دی.ان.ای از بافت گیاهی برای پی.سی.آر

جداسازی دی.ان.ای از بافت گیاهی برای پی.سی.آر   1- 100 میلی گرم برگ تازه را در ای-لوله 1/5  میلی لیتری (اپندورف تیوب)  دارای 400 میکرولیتر بافر جداسازی دی.ان. ای هموژنه کنید. *می توانید ابتدا بافت گیاهی را در نیتروژن مایع با کمک هاون بسایید و سپس به آن بافر را بیافزایید یا که ابتدا 200 میکرولیتر روی بافت گیاهی درون لوله بریزید و پس از همگن کردن با استفاده از همگن کننده 200 میکرولیتر دیگر بافر را بیافزایید.   2-ابتدا به شدت لوله را تکان بدهید . سپس به مدت 15 دقیقه در 65 درجه سانتیگراد یا 1ساعت در دمای اتاق (25 درجه سانتیگراد) بگذارید.   3-در 4 درجه سانتیگراد/12000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ کنید.   5-لایه رویی را به یک ای-لوله تمیز منتقل کنید و هم حجم آن  پی.سی.آی  روی آن بریزید و باشدت تکان دهید.   6- در 4 درجه سانتیگراد/12000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ کنید.   7--لایه رویی را به یک ای-لوله تمیز منتقل کنید و هم حجم آن  آی.پی.ای(ایزوپروپانول)  روی آن بریزید و به آرامی چند بار برگردانید.   8-به مدت 30 دقیقه در منفی 20 درجه سانتیگراد بگذارید.   9- در 4 درجه سانتیگراد/12000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ کنید.   10- با احتیاط الکل را دور بریزید.سپس رسوب دی.ان.ای را با اتانول 70% بشویید.   11- رسوب را خشک کنید تا الکلی در آن نماند.   12- بسته به اندازه رسوب آن را در چند تا چند ده میکرولیتر آب اتوکلاو شده یا بافر تی.ای حل کنید(معمولا 20 میکرولیتر).   13- نیم میکرولیتر آر.ان.ایز ایRNase A  با غلظت 10 میلی گرم در میلی لیتر به آن بیافزایید و 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهدارید.   14-کیفیت دی.ان.ای و مقدار آن را اندازه گیری کنید .سپس با استفاده از این دی.ان.ای  واکنش پی.سی.آر را انجام دهید.    

جداسازی آر.ان.ای از بافت سبز گیاهی

جداسازی آر.ان.ای از بافت گیاهی (بارگذاری فایل پی.دی.اف)1- 100-500 میلی گرم  برگ تازه را در نیتروژن مایع  بسایید.2- این مقدار پودر را در 1-2  ای –تیوب به حجم 1/5 میلی لیتربریزید*قبلش میکروتیوبها را در نیتروژن مایع سرد کنید. بافت گیاهی نباید گرم شود.3- بی درنگ 1 میلی لیتر ترایزول® به هر لوله اضافه کنید4-در لوله هارا ببندید و به مدت 10 دقیقه به شدت تکان دهید(ورتکس کنید).5-در دمای اتاق بگذارید لوله ها به مدت5 دقیقه آرام بگیرند.6-به مدت 10 دقیقه با 12000 g در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ کنید.7-با احتیاط لایه رویی را به یک لوله تمیز منتقل کنید و 250 میکرولیتر  کلروفورم به آن بیافزایید.8-ابتدا 30 ثانیه به شدت تکان دهید. سپس به مدت 2 دقیقه در ورتکس به شدت تکان دهید.9- در دمای اتاق بگذارید لوله ها به مدت 2 دقیقه آرام بگیرند.10- به مدت 15 دقیقه با 12000 g در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ کنید.11-لایه رویی را با احتیاط بردارید و به یک لوله تمیز منتقل کنید( حدود 55-60% حجم ترایزول ).13- هم حجم آن  فنل : کلروفورم (50:50)   یا پی . سی. آی (فنل : کلروفورم : ایزو آمیل آلکل) بیافزایید.14- ابتدا 30 ثانیه به شدت تکان دهید. سپس به مدت 2 دقیقه در ورتکس به شدت تکان دهید.15- در دمای اتاق بگذارید لوله ها به مدت 2 دقیقه آرام بگیرند.16- به مدت 15 دقیقه با 12000 g در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ کنید.17-لایه رویی (فاز آبی) را با احتیاط به لوله بدون آر.ان ایز RNase منتقل کنید.* دقت کنید از لایه سفید رنگ و درد- مانند زیرین وارد پیپت نشود.18-هم حجم آن ایزوپروپانول (آی.پی.ای) به لوله اضافه کنید و به مدت 45-30 دقیقه در یخ بگذارید.19- آر.ان.ای را با سانتریفوژ در دمای 4 درجه  سانتیگراد به مدت 20 دقیقه با 12000 g رسوبگذاری کنید.20- با احتیاط الکل را دور بریزید و 500 میکرولیتر اتانول 75% به رسوب بیافزایید.به مدت 15-20 دقیقه در دمای اتاق به شدت تکان بدهید تا آر.ان.ای شستشو شود.21- 8 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد و 12000 g سانتریفوژ کنید.22-اتانول را دور بریزید و 10-20 دقیقه رسوب آر.ان.ای را خشک کنید اما نه به طور کامل چون به سختی در آب حل می شود.23- رسوب آر.ان.ای را در مقدار آب متناسب با اندازه  رسوب  حل کنید.* می توانید آر.ان.ای را در بافر تی.ای  دارای یک درصد اس.دی .اس حل کنید.* پی اچ بافر ها و محلولها برای استخراج و جداسازی آر.ان.ای نباید بالای 8 باشد.* آب مورد استفاده باید بدون آر.ان.ایز باشد و با دی.ای.پی.سی در طول شب تیمار شده باشد و پس از آن اتوکلاو شده باشد.*در کار با آر.ان .ای همیشه باید دستکش پوشید.*این دستور کار در اصل برای کلامیدوموناس طراحی شده است.

مقدمه - نکاتی که باید بدانید

مقدمه - آنچه باید بدانید ابتدای کار باید بدانید چه می خواهید و چه مراحلی برای رسیدن به هدف نهایی در آزمایش باید طی کنید. به همین منظور: ۱- هدف نهایی را بنویسید. ۲-مراحل آزمایش را به صورت کلی بنویسید. ۳- مرور مقالات کنید و مطالعه ای جامع انجام دهید.مزیت این کار این است که کار تکراری نمی کنید و این که چشم بسته کاری را به صرف علاقه به انجام آن شروع نمی کنید. ۴- بر پایه روش کارهای مقالات و هند بوک ها که حاوی روشهای عملی کار هستند بر اساس کلیات طرح خود ریز فهرست روشها و مواد لازم و هزینه های مربوطه را تهیه کنید.( هزینه ها در ایران بسیار مهمند و حتی در خارج). گاهی باید بین این که کدام روش را به کار ببرید و هزینه انجام آن و وقتی که می توانید برای انجام کار بگذارید از بخشی از مثلا انجام دادن یک روش جدید ، گرانتر  سریعتر و دقیق تر چشم پوشی کنید و روشی زمان برتر و ارزان تر را انجام دهید بدون این که به ارزش علمی کارتان صدمه برسد. ۵- همیشه به روز باشید و قبل از انجام هر مرحله جدید از آخرین انتشارات در زمینه  پژوهش خود اطلاع پیدا کنید و بر اساس نتایج مراحل قبلی کار و داده های جدید علمی به پیش بروید. ۶- همیشه مطمئن شوید تمام  مواد و سایل لازم را برای انجام هر قسمت از آزمایش فراهم کرده اید و بعد شروع کنید. برای مثال اگر نیازمند هیت بلاک یا حمام گرم۴۲ درجه هستید قبلش دستگاه را تنظیم کنید یا روز قبل از به طور مثال ترانسفورماسیون باکتری مطمئن شوید محیط کشت مورد نظر با آنتی بیوتیک مورد نظر برای گزینش باکتری به میزان کافی ( جامد یا مایع ) وجود داشته باشد. ۷- تمام محلول ها و محیط های کشت را در دمای توصیه شده نگهداری کنید. ۸-تمام مراحل دستور کار را دقیقا انجام دهید مگر این که دارای تجربه کافی باشید که بر اساس آن برخی مراحل را تغییر دهید و بهینه سازی کنید.  ۹-تمامی محلول ها و محیط های کشت را برچسب مطمئن (که بااتوکلاو کردن یا سرریز شدن احتمالی محلول پاک نشود) و تاریخ بزنید و برای نامگذاری مخفف سعی کنید از یک روش استاندارد که همه افراد آزمایشگاه بدانند استفاده کنید. ۱۰-در هنگام درست کردن محلول برای اتوکلاو کردن همیشه حجم محلول یا محیط کشت را کمتر از دوسوم حجم ظرف موجود در نظر بگیرید و بهتر است برای مثال ۵۰۰ میلی لیتر محیط کشت دارای آگار را در ظرف یک لیتری استریل کنید. ۱۱-تمام قوانین ایمنی به ویژه ایمنی زیستی را رعایت کنید و حتما محیط های کشت شده دور ریختنی را قبل از دور ریختن اتوکلاو کنید. ۱۲-در کار با مواد شیمیایی خطرناک و یا مواد رادیواکتیو فقط و فقط در محل اختصاص داده شده کار کنید و از دور ریختن آنها در چاهک یا ظرفشویی به شدت خودداری کنید و آنها را در دبه های ویژه آن خالی کنید. ظروف یک بار مصرف آلوده به مواد رادیواکتیو را در آشغالدان ویژه آن بریزید. ۱۳-همیشه در کار با مواد بالا دستکش و روپوش بپوشید و پشت صفحه های محافظ در برابر پرتو کار کنید.در پایان کار بد نیست لوازم و لباس خود را هم با شمارنده گایگر بررسی کنید. ۱۴-همیشه هنگام حمل مواد رادیو اکتیو آنها را در ظروف خاص خودشان و تا حد امکان دور از بدن(به ویژه اندام پایینی بدن) گرفته، حمل کنید. ۱۵- در صورت پاشیدن مواد رادیو اکتیو به بیرون مسوولین مربوطه را مطلع کنید و پنهانکاری نکنید.در صورت پنهانکاری این مواد به صورت گسترده در همه جا پخش خواهند شد و سلامت همه از جمله خود شما را به خطر خواهند انداخت. ۱۶-آزمایشگاه باید تهویه کافی و مناسب داشته باشد. ۱۷-از آنجا که در آزمایشگاههای ملکولی بیشتر از مواد خطرناک و حتی سرطان زا استفاده می شود و با ارگانیسم هاس دستکاری شده ژنتیکی سر و کار دارید از خوردن و آشامیدن در محیط کار خودداری کنید وازاتاق مطالعه یا استراحت استفاده کنید.پوشیدن دستکش را هم فراموش نکنید. ۱۸-همیشه میزکار و وسایل خود را قبل و بعد از کار با اتانول ۷۰ درصد تمیز کنید. ۱۹-قبل از ترک آزمایشگاه وسایل برقی یا گازی آزمایشگاه را بررسی کنید. ۲۰-پیپت های خود را در پایان کار روی آخرین عدد حجمی آن بگذارید تا به مرور زمان از دقت آن کاسته نشود. ۲۱-تمام پادزیها و هورمونها و سایر ترکیبات حساس به حرارت را پس از اتوکلاو محلول مورد نظرتان و استریل کردن با فیلتر  به محلول اضافه کنید. ۲۲-برخی محلول ها یا بافرها حساس به نورند یا نباید اتوکلاو شوند .قبل از تهیه کردن محلول از ویژگیهای آن اطلاع پیدا کنید.محلول های حساس به نور را در شیشه مات در دار نگهداری کنید یا ظرف حاوی آنها را با ورقه آلومینیومی بپوشانید. ۲۳-همیشه محیط کارتان را اعم از آزمایشگاه، اتاق رشد، فیتوترون و گلخانه تمیز نگهدارید.احتمال آلودگی به قارچ و آفت های گیاهی فراوان است.گلخانه را هر از چند گاهی ضدعفونی کنید و همیشه قبل از گسترش آفت سمپاشی را به طور منظم انجام دهید. ۲۴-نمونه های گلدانی بدون استفاده را نابود کنید و ظروف و گلدانهای استفاده شده را بشویید. ۲۵-اگر نمونه گلدانی را با خاک می خواهید در فیتوترون نگهداری کنید باید حتما خاک را اتوکلاو کنید و بعد استفاده کنید.  ۲۶- به مرور زمان از شدت نوردهی لامپ ها کاسته می شود.هر چند وقت با نورسنج شدت نور موجود در فیتوترون یا اتاق رشد را بررسی کنید.  ۲۷-در تهیه محلول ها همیشه از استوانه مدرج استفاده کنید.هرگز به درجه بندی بشر یا ظرف ارلن اطمینان نکنید.

همانند سازی دی.ان.ای

ساختار دی.ان.ای

دی.ان.ای دارای دو رشته است که از خشت های ساختمانی به نام نوکلیوتید ساخته می شود که با ساختار پلکانی مارپیچی آرایش یافته اند. هر نوکلیوتید از ۳ بخش ساخته می شود:یک گروه فسفات یک ملکول قند و یکی از ۴ باز آدنین گوانین سیتوزین و تیمین . پیوند های قند - فسفات ستون مهره های دوتایی ؛ دستگیر های(نرده های) پلکان؛ را تشکیل می دهند اما کلید ژنتیکی دی.ان.ای را در پله ها؛بازهای نیتروژن دار می یابیم.این بازها با پیوندهای نیتروژنی به طور کاملا ویژگی یافته به هم متصل می شوند. آدنین فقط با تیمین پیوند می یابد A  با T  و سیتوزین فقط با گوانین پیوند می یابد C با G.در حالی که این جفت شدن بنبادین هرگز تغییر نمی یابد ترتیب هر جفت درطول این رشته از یک گونه به گونه دیگر تنوع فوق العاده ای دارد. در این طراحی عالی می بینیم طبیعت چطور دستور العمل ساختن همه موجودات زنده را ذخیره می کند.

آر.ان.ای تداخلی (آر.ان.ای آی)