جداسازی آر.ان.ای از بافت سبز گیاهی
دوشنبه, ۳۰ دی ۱۳۸۷، ۰۷:۳۳ ق.ظ
جداسازی آر.ان.ای از بافت گیاهی (بارگذاری فایل پی.دی.اف)1- 100-500 میلی گرم برگ تازه را در نیتروژن مایع بسایید.2- این مقدار پودر را در 1-2 ای –تیوب به حجم 1/5 میلی لیتربریزید*قبلش میکروتیوبها را در نیتروژن مایع سرد کنید. بافت گیاهی نباید گرم شود.3- بی درنگ 1 میلی لیتر ترایزول® به هر لوله اضافه کنید4-در لوله هارا ببندید و به مدت 10 دقیقه به شدت تکان دهید(ورتکس کنید).5-در دمای اتاق بگذارید لوله ها به مدت5 دقیقه آرام بگیرند.6-به مدت 10 دقیقه با 12000 g در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ کنید.7-با احتیاط لایه رویی را به یک لوله تمیز منتقل کنید و 250 میکرولیتر کلروفورم به آن بیافزایید.8-ابتدا 30 ثانیه به شدت تکان دهید. سپس به مدت 2 دقیقه در ورتکس به شدت تکان دهید.9- در دمای اتاق بگذارید لوله ها به مدت 2 دقیقه آرام بگیرند.10- به مدت 15 دقیقه با 12000 g در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ کنید.11-لایه رویی را با احتیاط بردارید و به یک لوله تمیز منتقل کنید( حدود 55-60% حجم ترایزول ).13- هم حجم آن فنل : کلروفورم (50:50) یا پی . سی. آی (فنل : کلروفورم : ایزو آمیل آلکل) بیافزایید.14- ابتدا 30 ثانیه به شدت تکان دهید. سپس به مدت 2 دقیقه در ورتکس به شدت تکان دهید.15- در دمای اتاق بگذارید لوله ها به مدت 2 دقیقه آرام بگیرند.16- به مدت 15 دقیقه با 12000 g در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ کنید.17-لایه رویی (فاز آبی) را با احتیاط به لوله بدون آر.ان ایز RNase منتقل کنید.* دقت کنید از لایه سفید رنگ و درد- مانند زیرین وارد پیپت نشود.18-هم حجم آن ایزوپروپانول (آی.پی.ای) به لوله اضافه کنید و به مدت 45-30 دقیقه در یخ بگذارید.19- آر.ان.ای را با سانتریفوژ در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه با 12000 g رسوبگذاری کنید.20- با احتیاط الکل را دور بریزید و 500 میکرولیتر اتانول 75% به رسوب بیافزایید.به مدت 15-20 دقیقه در دمای اتاق به شدت تکان بدهید تا آر.ان.ای شستشو شود.21- 8 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد و 12000 g سانتریفوژ کنید.22-اتانول را دور بریزید و 10-20 دقیقه رسوب آر.ان.ای را خشک کنید اما نه به طور کامل چون به سختی در آب حل می شود.23- رسوب آر.ان.ای را در مقدار آب متناسب با اندازه رسوب حل کنید.* می توانید آر.ان.ای را در بافر تی.ای دارای یک درصد اس.دی .اس حل کنید.* پی اچ بافر ها و محلولها برای استخراج و جداسازی آر.ان.ای نباید بالای 8 باشد.* آب مورد استفاده باید بدون آر.ان.ایز باشد و با دی.ای.پی.سی در طول شب تیمار شده باشد و پس از آن اتوکلاو شده باشد.*در کار با آر.ان .ای همیشه باید دستکش پوشید.*این دستور کار در اصل برای کلامیدوموناس طراحی شده است.
