جداسازی دی.ان.ای از بافت گیاهی برای پی.سی.آر
1-
100 میلی گرم برگ تازه را در ای-لوله 1/5 میلی
لیتری (اپندورف تیوب) دارای 400 میکرولیتر بافر جداسازی دی.ان. ای هموژنه کنید.
*می توانید
ابتدا بافت گیاهی را در نیتروژن مایع با کمک هاون بسایید و سپس به آن بافر را
بیافزایید یا که ابتدا 200 میکرولیتر روی بافت گیاهی درون لوله بریزید و پس از
همگن کردن با استفاده از همگن کننده 200 میکرولیتر دیگر بافر را بیافزایید.
2-ابتدا به شدت لوله را تکان بدهید . سپس به مدت 15 دقیقه
در 65 درجه سانتیگراد یا 1ساعت در دمای اتاق (25 درجه سانتیگراد) بگذارید.
3-در 4 درجه سانتیگراد/12000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه
سانتریفوژ کنید.
5-لایه رویی را به یک ای-لوله تمیز منتقل کنید و هم حجم
آن پی.سی.آی روی آن بریزید و باشدت تکان دهید.
6- در 4 درجه سانتیگراد/12000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه
سانتریفوژ کنید.
7--لایه رویی را به یک ای-لوله تمیز منتقل کنید و هم حجم
آن آی.پی.ای(ایزوپروپانول) روی آن بریزید و به آرامی چند بار برگردانید.
8-به مدت 30 دقیقه در منفی 20 درجه سانتیگراد بگذارید.
9- در 4 درجه سانتیگراد/12000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه
سانتریفوژ کنید.
10- با احتیاط الکل را دور بریزید.سپس رسوب دی.ان.ای را با
اتانول 70% بشویید.
11- رسوب را خشک کنید تا الکلی در آن نماند.
12- بسته به اندازه رسوب آن را در چند تا چند ده میکرولیتر
آب اتوکلاو شده یا بافر تی.ای حل کنید(معمولا 20 میکرولیتر).
13- نیم میکرولیتر آر.ان.ایز ایRNase A
با غلظت 10 میلی گرم در میلی لیتر به آن بیافزایید و 30 دقیقه در دمای 37
درجه سانتیگراد نگهدارید.
14-کیفیت دی.ان.ای و مقدار آن را
اندازه گیری کنید .سپس با استفاده از این دی.ان.ای واکنش پی.سی.آر را انجام دهید.
